目前在全世界范围内，牛的人工授精已普遍采用冷冻精液输精。因此，在奶 牛人工授精中的精液品质检查，主要是指在输精前后，对解冻后的精液进行检查。 国内外公牛的冷冻精液都有严格的质量标准，用户对其质量的检查主要是进一步核 实其质量，了解或发现操作中的问题。

一、 精子解冻活率检查

（一）颗粒冷冻精液 取消毒并封装于安瓿内的稀释液（一般为2．9％柠檬酸 钠1毫升），放于40℃的温水中，待其温度接近40℃时，打开安瓿放入颗粒冷冻精液1粒，轻轻摇动，使其融化，即可取样在高倍显微镜下观察其活率。 检查时显微载物台的温度应保持在37℃左右。在评定活率时，要注意上、中、下三个层次精 子活率的变化，左、右、上、下四个方位视野的差异，才能做出较准确的判断。活 率在0．3以上即为合格精液。

（二）细管冷冻精液 可直接投入40℃温水中，待其融化后，立即取出，剪去棉塞一端，取样检查。

二、 死活精子比例检查 先将精子死活染色液分装于容量为0．5毫升左右的指形玻璃小管中，染色液 为伊红。苯胺黑溶液（含5％水溶性伊红和1％苯胺黑溶液），染色前先放入37℃恒 温箱或水浴箱中预热，滴入解冻精液2～3滴，混匀后再放入温箱，3 分钟后即可制做抹片，待抹片风干革命后在油镜下观察。死精子为红色，活精子不 着色或只在头部的核环处呈淡红色。随机观察200个精子并计算出死、活精子的比例。 用这种方法所得到的活精子百分数要高于精子的活率。对于活率观察，技术熟练、估计准确的人 员可不做精子死活染色的检查。

三、 密度检查 对精子密度检查的最简单方法是，取1滴解冻精液在低倍显微镜下凭经验粗略 地估计其密度是否符合输精的要求。 较精确的方法是采用血球计数装置，进行精确的计算，具体方法在这里不作 介绍。以此为基础建立起来的光电比色法测定精液中精子密度，已经被大型公牛站广泛应用。 通过密度的检查可以计算出被检精液每毫升所含的精子数，再根据解冻后的 活率可得每毫升精液中的有效精子数（即呈直线前进运动的精子数），最后乘以输精剂量（颗粒冷冻精液为0．1±0．01毫升；细管冷冻精液为0．5毫升或0．25毫升） 计算出每个输精剂量的有效精子数（颗粒冷冻精液为1200万以上；细管冷冻精液为 1000万以上）。

四、 其他方面的检查 包括畸形精子的比例、顶体完整率、生存指数等方面的检查。在一般生产条件下是不进行的，只有在输精后母牛的受胎率明显下降又很难找到确切的原因时，才送交有关实验室进行这些项目的检查。 第三节 奶牛精液的冷冻保存 到目前为止，在各种家畜中，牛的精液冷冻保存技术最为成功，已形成一套完整定型的工艺流程。
（一）、 冷冻稀释液的选择和配制

（1）稀释液的选择牛冷冻精液稀释液的种类较多， 可根据自身的经验和条 件选用并固定1～2个最适宜的稀释液配方。

（2）稀释液的配制原则 第一，配制稀释液所使用的一切用具，必须经认真清洗和严格消毒。 第二，稀释液要现用现配，保持新鲜，经密封、消毒的稀释液，允许在0～5℃ 的冰箱中保存1周。但卵黄、抗生素、酶、激素等有生物活性的物质， 必须在用前 临时添加。 第三，稀释用水应为蒸馏水或重蒸馏水，要求保持新鲜、中性。 第四，配制稀释液所用的化学制剂要纯净，一般要求化学纯或分析纯；称量 要准确无误，经充分溶解、过滤后进行消毒（隔水煮沸或蒸气消毒）。 第五、卵黄和奶类成分要求新鲜、无污染、无杂质。 第六，抗生素等有生物活性的物质，必须在稀释液冷却至室温时加入，以免 失去活性。 （二）、精液的稀释

（1）稀释倍数的确定对原精液的稀释倍数主要依据精液的精子密度和活率， 以及精子解冻后的活率来确定，虽无具体规定，但必须保证每个输精剂量中，在解 冻后所含的有效精子（直线前进运动的精子）数达到规定的标准。例如，60年代， 国外冷冻精液的稀释倍数只有一个大致的范围，英国不超过50倍，爱尔兰10倍左右， 法国9～23倍，前苏联10～25倍，美国为30～50倍，保证每个输精剂量有1500 万有 效精子。 我国当前在颗粒冷冻精液的生产中，由于颗粒体积的缩小和解冻后的再稀释， 一般按原精液做1：2～4倍稀释。滴冻颗粒为0．1毫升，解冻时每毫升的解冻液加 入一粒，即为一个输精剂量。其中含有效精子不少于1000万，仍可获得理想的受胎 效果。实际上，其最终稀释倍数是30倍左右。

(2）稀释方法 甘油是牛精液冷冻保存的重要保护剂，但它对精子同时也具有性。为减低甘油对精 子的有害作用，多采用两次稀释，即采精后先用不含甘油的 第一液稀释到最终稀释倍数的一半，经缓慢降温（不少于60分钟）至4～5℃的温度 下，再加入同温等量含甘油的第二液。第二液的加入方法有一次或多次加入，以及 缓慢滴入等方法。甘油的最终浓度通常为7％。 近年来，在试验的基础上，我国有的采用一次稀释的方法。即采精后用同温 的含甘油稀释液一次稀释完成，也取得了良好的冷冻保存效果。

（三）、精液的低温平衡 平衡是指精液加入含甘油的稀释液后，需在4～5℃的条件下放置的时间。在 此之前，首先要把采精后稀释的精液缓慢降温至4～5℃。具体做法是：将装精液的 容器外面包以纱布、棉花，或放入同温的水中，再放入0～5℃的冰箱中，经1 小时即可达到降温的目的。 牛精液在冷冻前各国采用的平衡时间差异较大，我国一般在2～4小时。

（四）、精液分装和冻结

（1）分装牛精液在冷冻前可采用玻璃安瓿、塑料细管和颗粒3种分装方法。 目前应用较多的是后面两种，并且细管法日渐增多。颗粒法虽有容积小、操作简单、 成本低、快速冻结效果好等优点，但存在着不易标记、易破损和污染以及解冻再稀 释等问题。 细管法具有卫生条件好、容积小、可快速冷冻、精子损耗少，、易标记和适 于机械化生产等优点。到目前为止，我国仍多采用颗粒法冷冻，但已逐步向细管法 过渡。 精液分装前，塑料细管要用打印机作好有关标记（公牛号、品种、生产日期 等），并在紫外线灯下照射消毒。 分装是用专门的机械进行的，分装后即可放入0～5℃的。冰箱缓慢降温和平 衡，时间与颗粒法相似。 冻结时，将平衡后的细管平放在纱网上，放置在距离液氮面2～3厘米处，停 留7～8分钟，随后浸入液氮。经抽样检查合格后，即可按一定包装规格包装并在液 氮中长期保存。

（2）冻结 牛精液冷冻的冷源普遍应用液氮。颗粒精液在经液氮冷却的氟板（聚四氟乙烯）、铜纱网、铝板上滴冻。要使承 接精液的表面与液氮面保持一定的距离（1～2厘米）。在滴冻的过程中，要维持一 80～一120℃的温度。滴冻前要将经平衡的精液充分混匀。并检查精子的活率。 滴要迅速，颗粒要均匀，每毫升经过稀释的精液滴10粒左右为宜。滴冻结束后，要 停留2～3分钟，待所有颗粒已冻结立即投入液氮。经抽样检查（一般随机抽取2粒） ，解冻活率在0．3以上者，即可装于纱布袋中，经标记后在液氮中保存。每滴冻完 一头公牛的精液后，必须更换氟板等用具。 目前，细管的容量分0．25毫升和0．5毫升两种，由无毒塑料（聚氯乞烯）制 成。管的一端填有棉塞和聚乙烯粉未，粉未遇水即固化自动封口，输精时又成为推 送精液的活塞；另一端在注入精液后，可以聚乙烯粉或钢珠（或塑料珠）封口，要 注意在封口处与精液间留有10～13毫米的空间，防止冷冻过程中咽膨胀引起细管爆裂。